La cicatrisation de la peau humaine transplantée sur la souris nude suite à une plaie profonde impliquant le derme et l’épiderme

Pour étudier la reconstruction de la peau suite à des plaies impliquant l’ensemble de l’épaisseur de la peau humaine   greffée, deux mois après la transplantation des plaies traversant toute l’épaisseur de la peau greffée ont été créées au centre du greffon (de diamètre 1 cm) à l’aide d’un punch d’un diamètre de 2 mm. Puis, à des stades allant de 2 jours à plus de 3 mois après la création de la plaie, les greffons ainsi que la peau périphérique de souris ont été prélevés, congelés dans l’azote liquide, coupés au cryostat, puis étudiés par immunofluorescence indirecte avec toute la batterie d’anticorps dont nous disposions.

Les différentes étapes de l’analyse de la cicatrisation de la peau humaine transplantée sur la souris nude

La reconstruction de la peau humaine transplantée se fait par la mise en jeu de toute une série de phénomènes extrèmement complexes que nous allons artificiellement séparer mais qui sont, en fait, étroitement interdépendants. Les principales étapes de la cicatrisation   de la peau humaine transplantée sur la souris « nude » sont schématisées dans la figure ci-dessous :

Les différentes étapes de la cicatrisation de la peau humaine transplantée sur la souris nude

 1. La formation du tissu de granulation  

Immédiatement après la création de la plaie, un caillot sanguin se forme rétablissant ainsi une barrière provisoire avec l’extérieur. Puis sous ce dernier, se déroulent toute une série de processus inflammatoires que nous avons très peu étudiés. Toutefois, l’utilisation des anticorps spécifiques d’espèce démontre que ce sont des cellules de souris qui interviennent dans la réaction inflammatoire. Dans la première semaine, des cellules de souris et des capillaires sanguins vont envahir l’espace situé sous le caillot sanguin et former le tissu de granulation. Cette dénomination provient de l’observation dans une coupe de ce tissu, d’un grand nombre de petits granules. Ces derniers sont, en fait, une multitude de petits vaisseaux sanguins nouvellement formés. Une semaine après la création de la plaie, ce tissu comporte un grand nombre de cellules inclus dans une matrice riche en fibronectine et relativement pauvre en collagène   de type I. L’origine des cellules qui composent le tissu de granulation est depuis longtemps un sujet de discussion. En effet, il n’est pas encore bien défini si les cellules qui le composent, proviennent du derme   environnant lésé ou d’une autre source. Dans le cas présent, les immunomarquages faits avec les anticorps spécifiques d’espèce dirigès contre les antigène de type HLA-ABC, la vimentine, les collagènes de types I ou IV de souris ou humains, démontrent clairement qu’il n’est pas produit par des cellules d’origine humaine mais par des cellules de souris dont l’origine reste encore à définir.

Origine et composition du tissu de granulation au cours de la cicatrisation de la peau humaine greffée sur la souris nude :

Dans ces 4 figures, 7 jours après la création de la plaie, les immunomarquages faits avec les anticorps spécifiques d’espèce dirigés contre la vimentine ou le collagène de types I de souris ou humain, démontrent clairement que le tissu de granulation n’est pas produit par des cellules d’origine humaine mais par des cellules de souris qui vont produire, en son sein, du collagéne de type I. Les antigènes détectés par les anticorps apparaissent en jaune-vert et l’ensemble du tissu est soit pour les marquages de la vimentine contrecoloré en rouge par le bleu Evans, soit pour les marquages du collagène de type I non contrecoloré.

Une étude en microscopie électronique à transmission démontre la présence de « myofibroblastes » qui sont les cellules caractéristiques du tissu de granulation et qui ont été bien décrite par Gabbiani dès 1971. En utilisant la phalloidine, une toxine qui se lie à l’actine, et par une réaction sur coupe congelée avec cette substance préalablement conjugué à la rhodamine, nous avons confirmé que ces cellules contiennent un réseau fibrillaire d’actine très développé. En microscopie électronique, nous avons également observé qu’elles semblent établir entre elles des liaisons de type « gap junction » et qu’elles sont individuellement entourées par une structure ressemblant à une membrane basale.

Marquage en immunofluorescence indirecte de la fibronectine et de l’actine du tissu de granulation, 7 jours et 3 semaines après création de la plaie au centre d’un greffon de peau humaine sur la souris nude.

On peut observer qu’à 7 jours après création de la plaie, le tissu de granulation est riche en fibronectine et en cellules positives pour l’actine alors qu’à 3 semaines, le marquage pour la fibronectine est plus diffus et celui pour l’actine est limité au vaisseaux sanguins et à l’épiderme.

Par immunomarquage nous avons observé que l’ensemble du tissu de granulation est coloré par des anticorps dirigé contre le collagène de type IV, la laminine, ou un protéoglycane riche en sulfate d’héparane avec toutefois un marquage plus intense au niveau des vaisseaux sanguins. Ces trois glycoprotéines sont probablement des constituants de la membrane basale des myofibroblastes puisqu’à des stades plus tardifs quand les myofibroblastes auront disparu, elles seront détectées uniquement au niveau des vaisseaux sanguins. Ces cellules jouent un rôle actif dans le phénomène de contraction de la plaie dont le diamètre n’est plus que de l’ordre de 1.5 mm, 7 jours après sa création.

 2. Migration de l’épiderme  

Pendant que le tissu de granulation est en train de se former, des modifications importantes se déroulent au niveau de l’épiderme humain non lésé. A la périphérie de la plaie et sur une distance de 100 à 200 mm, l’épiderme humain se nécrose. Au contact de ce tissu nécrotique, l’épiderme immédiatement contigu s’épaissit et forme un bourgeon épidermique clairement distinguable au stade 48h.

Au quatrième jour, des cellules épidermiques humaines, qui réagissent avec un anticorps anti-HLA-ABC, commencent à migrer vers la zone lésionnelle. Au septième jour, elles constituent une langue épidermique qui, en pénétrant dans la plaie, sépare le tissu de granulation sous-jacent de la croute. Cette dernière est donc constituée du caillot sanguin, de la partie d’épiderme qui s’est nécrosée, et d’un certain nombre de cellules inflammatoires accumulées sous le caillot. Des observations en microscopie électronique révèlent que les cellules migratrices à l’extrémité de la langue épidermique sont hérissées de courts prolongements cytoplasmiques ou pseudopodes qui entrent en contact direct avec les cellules et la fibrine   du tissu de granulation. Il est probable que par ces pseudopodes, les kératinocytes   humains secrètent des enzymes protéolytiques et phagocytent une partie du matériel digéré afin de pouvoir pénétrer dans ce tissu inflammatoire.

On notera l’absence de membrane basale et la présence de prolongements cytoplasmiques ou pseudopodes à partir du kératinocyte.

Par immunomarquage, nous avons pu observer qu’il y a de la fibronectine et de la fibrine accumulées sous l’extrémité de la langue épidermique alors que le collagène de type IV et la laminine sont absents. L’antigène BP détecté par le sérum de malades atteints de la pemphigoïde bulleuse est présent jusqu’à la pointe de la languette de réépithélialisation mais reste intracellulaire. Dans des zones en arrière de la région de migration, où l’épiderme semble s’être stabilisé, le collagène de type IV et la laminine sont, de nouveau, déposés mais de façon discontinue. En microscopie électonique, une lamina densa fragmentée est observée dans cette région.

Montage photographique montrant l’extrémité de la langue épidermique et une zone de la peau non lésée, 7 jours après création de la plaie au centre du greffon de peau humaine sur la souris nude. Marquage en immunofluorescence indirecte mettant en évidence la fibronectine ou le fibrinogène qui apparaissent en blanc.

On observe un dépot de fibrinogène sous la langue épidermique alors qu’il est absent à la jonction dermo-épidermique dans la zone non lésée de la peau humaine.

Montage photographique montrant l’extrémité de la langue épidermique et une zone de la peau non lésée, 7 jours après création de la plaie au centre du greffon de peau humaine sur la souris nude. Marquage en immunofluorescence indirecte mettant en évidence le collagène de type IV humain ou la laminine qui apparaissent en blanc. La flêche en jaune indique l’extrémité de la langue épidermique.

On peut voir qu’à 7 jours après la plaie, le collagène de type IV humain et la laminine sont exprimés à la jonction entre l’épiderme et le tissu de granulation mais sont absent à la partie la plus extrème de la langue épidermique. Il n’y a pas de collagène de type IV humain au niveau des membranes basales des vaisseaux sanguins alors que la laminine identifiée par un anticorps non spécifique d’espèce est identifiée à leur niveau.

Finalement deux semaines après la création de la plaie, un nouvel épiderme constitué de cellules humaines, a recouvert la zone cicatricielle. C’est à ce stade que la croûte se décolle.

Les cellules épidermiques de la peau humaine transplantée sont donc capables de reconstruire un épiderme au dessus d’un tissu de granulation de souris. Pour cela, elles migrent sur une matrice composée essentiellement de fibrine et de fibronectine et dépourvue de laminine et collagène de type IV. Des observations analogues avaient été faites lors de la cicatrisation de la peau de cobaye ou du porc. Les modifications ultrastructurales observées au cours de ce processus sont très semblables à celles décrites dans la cicatrisation de la peau humaine « in situ ». Il semble donc que la reconstruction de l’épiderme humain dans la peau humaine transplantée se fait selon des mécanismes très comparables à ceux qui sont observés dans des conditions normales.

 3. Reconstruction de la jonction dermo-épidermique  

Lorsque la plaie est entièrement réépidermisée, le tissu de granulation va être progressivement remodelé. A trois semaines, une coupe transversale de la zone cicatricielle montre un épiderme légérement hyperplasique recouvrant un tissu conjonctif constitué d’un petit nombre de cellules dispersées dans une matrice extracellulaire   très développée, riche en collagène de type I et pauvre en fibronectine. Par immunomarquage avec les anticorps spécifiques d’espèce, il est clair qu’à ce stade, l’épiderme est humain alors que le tissu conjonctif sous-jacent est de souris.

A la jonction entre ces deux tissus, des dépôts linéaires de collagène de type IV humain, de collagène de type IV de souris et de laminine sont observés alors que la fibronectine est présente de façon discontinue et que la fibrine est absente.

Trois semaines après création de la plaie, on observe un dépot continu de collagène de type IV, de laminine et de l’antigène BP, à la jonction entre l’épiderme et le tissu de granulation. L’HSPG est exprimé de façon plus diffuse dans tout le tissu de granulation. La laminine est également exprimé au niveau de la membrane basale des vaisseaux sanguins alors que le collagène de type IV humain est absent.

En microscopie électronique à transmission, une membrane basale identique à celle de la jonction dermo-épidermique d’une peau normale est reconstruite. Elle comprend des hémidesmosomes, une lamina lucida et une lamina densa continues, des filaments d’ancrage s’enfonçant dans le tissu conjonctif sous-jacent, des fibrilles d’ancrage qui traversent la lamina lucida et relient les hémidesmosomes avec la lamina densa.

Ces résultats indiquent donc que des tissus provenant de deux espèces différentes, la souris et l’homme, sont capables de coopérer pour reconstruire à leur interface une jonction dermo-épidermique normale.

 4. Maturation de l’épiderme

Nous avons vu que, durant la phase de migration, les kératinocytes acquièrent des caractéristiques de cellules migratrices. Lorsque la plaie est complètement réépidermisée, l’épiderme cicatriciel doit ensuite recouvrir son architecture normale et les kératinocytes doivent reprendre un programme normal de différenciation qui aboutira à la formation des cornéocytes. Dans un autre article dédié à la transplantation de la peau humaine transplantée, nous avons vu qu’il existent des anticorps dirigés contre des kératines  , tels que ceux dénommés AE1 et KL1, ou dirigés contre l’involucrine  , un des précurseurs de l’enveloppe cornée  , qui peuvent permettre de définir le caractére de normalité d’un épiderme.

Dans une peau normale ou dans la peau humaine transplantée en dehors des zones de jonction avec la peau de souris, on observe un marquage strict de la couche basale de l’épiderme avec AE1, des couches suprabasales avec KL1 et du tiers supérieur de l’épiderme avec l’anticorps anti-involucrine. La distribution des kératines révélée par les anticorps AE1 et KL1 et celle de l’involucrine varient considérablement durant les différentes phases de la cicatrisation.

A 48h, dans le bourgeon épidermique au bord de la plaie, puis, dans la languette de réépithélialisation, à 7 jours, et dans l’épiderme nouvellement reconstruit, à 3 semaines, AE1 et l’anti-involucrine marquent les cellules suprabasales et KL1 tous les kératinocytes (voir figure ci-dessous).

A 6 semaines, les cellules basales mais également quelques cellules suprabasales sont marquées avec AE1 tandis que KL1 colorent fortement les cellules suprabasales et plus faiblement les cellules basales. A ce stade, l’involucrine est détectée dans le tiers supérieur de l’épiderme.

C’est seulement 9 semaines après la création de la plaie que l’épiderme cicatriciel redevient normal avec une coloration stricte des cellules basales avec AE1, des suprabasales avec KL1, de la couche granuleuse et de la partie supérieure de la couche spineuse avec l’anti-involucrine.

Trois mois après la création de la plaie, les distributions de l’involucrine et celle des kératines détectées par l’anticorps KL1 (en jaune) dans l’épiderme cicatriciel sont redevenues normales.

Il est intéressant que les mêmes observations aient été faites par JP Lacour et JP Ortonne lorsqu’ils ont étudiés la cicatrisation de la peau humaine « in situ ».

Il apparaît donc que, alors que l’épiderme est reconstruit dès 3 semaines, il ne retrouve ses caractéristiques normales que 6 semaines plus tard. Comme nous allons le voir ci-dessous, la normalisation de la différenciation épidermique est associée à l’apparition d’un néoderme   humain en remplacement du tissu de granulation de souris.

 5. Formation du néoderme

Entre la première et la sixième semaine après la création de la plaie, le tissu conjonctif est le siège d’importantes transformations. Le nombre de cellules diminue fortement et une importante matrice extracellulaire riche en collagène, se développe. Ce tissu de granulation remodelé, est constamment négatif avec les anticorps spécifiques de l’homme dirigés contre le collagène de type I ou la vimentine et fortement positif avec ceux dirigés contre les mêmes antigènes mais d’origine souris. Par contre, à 9 semaines, une bande de tissu contenant des cellules positives pour la vimentine humaine et du collagène de type I humain sépare l’épiderme reconstruit du tissu de granulation (voir figures ci-dessous).

Réorganisation du tissu de granulation en néoderme dans le modèle de la peau humaine transplantée sur la souris nude :

Dans ces figures, les anticorps utilisés pour ces marquages par immunofluorescence indirecte sont spécifiques des composants d’origine humaine et ne marquent pas ceux de souris. Les antigènes détectés par les anticorps apparaissent en jaune-vert et l’ensemble du tissu est coloré en rouge par le bleu Evans. On peut donc voir que, 6 semaines après la création de la plaie, l’épiderme reconstruit marqué par l’anticorps anti-HLA-ABC est humain alors que le tissu de granulation est négatif et donc d’origine murine. A ce stade, l’anticorps anti-vimentine humaine marque des cellules dans l’épiderme reconstruit mais pas encore dans le tissu de granulation sous—jacent ; ceux sont des mélanocytes humains et des cellules de Langerhans. A 9 semaines après la création de la plaie, on observe des cellules positives pour la vimentine humaine sous l’épiderme reconstruit ; ces cellules ont synthétisé du collagène de type I humain. Cela représente le début de la production du néoderme humain.

A 3 mois, le tissu cicatriciel souris a pratiquement disparu pour être remplacé par un néoderme marqué avec les anticorps spécifiques de l’homme dirigés contre les collagènes de type I, III, ou VI, contre les fibres élastiques   humaines ou contre la vimentine humaine (voir figures ci-dessous).

Ces résultats indiquent donc que, après avoir été profondément remodelé, le tissu de granulation qui a été produit par des cellules de souris, est progressivement remplacé par un néoderme fabriqué par des cellules provenant du derme humain environnant. Un double marquage avec les anticorps dirigés contre la vimentine humaine ou le collagène de type I de souris montre que ce phénomène résulte de l’invasion progressive du tissu de granulation par des cellules humaines à partir des bords de la plaie.

Ces dernières observations semblent donc démontrer que la reconstruction du tissu conjonctif dans une plaie cutanée se fait en deux étapes. Dans un premier temps, un tissu transitoire, le tissu de granulation, est produit par des cellules dont l’origine n’est pas encore clairement définie mais qui ne sont pas des cellules du derme voisin non lésé. Puis, ce tissu est finalement remplacé par un néoderme fabriqué par des cellules qui proviennent du derme.

 6. Les cellules de Langerhans   et les mélanocytes  

Nous avons vu dans un autre article que, les cellules de Langerhans et les mélanocytes sont présents dans la peau humaine transplantée. Il était intéressant d’étudier leur devenir au cours de la cicatrisation.

En utilisant les anticorps monoclonaux OKT6 et anti-HLA-DR, nous avons pu observer que les cellules de Langerhans colonisaient l’épiderme humain cicatriciel mais avec un léger retard par rapport à la migration des kératinocytes. Sept jours après la création de la plaie, elles sont détectées par microscopie électronique à transmission dans la langue épidermique, à distance de son extrémité. A 3 semaines, elles sont révélées par les anticorps et en microscopie électronique (voir figure ci-dessous).

Une cellule de Langerhans observée en microscopie électronique à transmission dans un épiderme cicatriciel, 3 semaines après création d’une plaie au centre d’un greffon de peau humaine sur la souris nude.

Les observations avec le microscope électronique montrent également que des mélanocytes (voir figures ci-dessous) sont présents dans l’épiderme cicatriciel, à 3 semaines. A ce stade, il n’y a pas de cellule épidermique marquée avec un anticorps anti-vimentine de souris dans la zone cicatricielle. Par contre, un certain nombre de cellules dendritiques dont certaines se situent en position basale, sont marquées par l’anticorps monoclonal anti-vimentine humaine. Il semble donc que les mélanocytes observés en microscopie électronique sont humains. Etant donné que juqu’à des stades tardifs, nous n’avons jamais observé de cellules positives pour la vimentine humaine dans le tissu de granulation, il est probable que la migration des cellules de Langerhans et des mélanocytes se fait dans l’épiderme entre les kératinocytes, à partir du pool de cellules préexistant dans l’épiderme humain non lésé.

Un mélanocyte humain observé en microscopie électronique à transmission dans un épiderme cicatriciel, 3 semaines après création d’une plaie au centre d’un greffon de peau humaine sur la souris nude.

 Bibliographie

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