Biologie de la peau

L’analyse par immunofluorescence indirecte

mercredi 24 mars 2010 par Michel Démarchez

Cette méthode tire profit de la propriété que possède un anticorps de se lier, de façon très spécifique, à l’antigène qui a suscité sa synthèse par les lymphocytes B. Elle permet de déterminer la localisation de cet antigène dans un tissu et donc, si celui-ci est associé à un certain type de cellule ou à un composant matriciel particulier, de définir sa distribution tissulaire.

Elle peut être réalisée selon deux méthodes différentes et sont faites sur des tranches très fines de tissu (d’une épaisseur de l’ordre de 5 mm) :

  • L’une dite directe consiste à faire incuber le tissu, avec l’anticorps étudié qui a été préalablement couplé à une molécule fluorescente (la fluorescéine ou la rhodamine, par exemple).
  • L’autre méthode, dite indirecte, se fait en deux étapes : 1) le tissu est mis à réagir avec l’anticorps qui nous intéresse ; 2) après rinçage, il est mis à incuber avec un deuxième anticorps dirigé contre les immunoglobulines de l’espèce où a été produit le premier anticorps et qui est couplé à la molécule fluorescente.
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Dans les deux cas, les coupes de tissu sont ensuite observées au microscope à UV   qui permet de localiser les zones où les molécules fluorescentes liées aux anticorps, eux-même liès aux antigènes étudiés.

Il apparaît tout de suite que le nombre et la valeur des informations que peut fournir cette technique sont étroitement dépendant de la spécificité et de la qualité des anticorps employés et de leur bonne caractérisation. Deux grandes techniques ont été utilisés pour produire les anticorps utilisés dans nos études sur la peau humaine   transplantée sur la souris « nude » : la première aboutit à la production d’anticorps polyclonaux et la deuxième à celle d’anticorps monoclonaux.

Trois catégories d’anticorps ont été utilisées pour réaliser nos recherche sur la peau humaine transplantée :

  • ceux qui ne présentent aucune spécificité d’espèce tel que l’anticorps anti-laminine qui décore les membranes basales, à la fois dans la peau humaine et dans la peau de souris ;
  • ceux qui montrent une spécificité stricte et qui, donc réagissent uniquement avec les molécules d’une des deux espèces tels que les anticorps dirigés contre les protéines de classe I ou II des complexes majeurs d’histocompatibilité de chacune des deux espèces ou contre l’involucrine   humaine ou contre les collagènes   de type I, III, IV, V, ou VI humains ;
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L’anticorps anti-HLA-ABC marque en jaune les cellules de la peau humaine greffée alors que les cellules de la peau de souris sont négatives. L’anticorps anti-involucrine humaine marque l’involucrine humaine présente dans les couches supérieures de la couche spineuse et la couche granuleuse de l’épiderme humain. La flèche blanche marque la jonction entre les épidermes humain et murin. Une contre-coloration au bleu Evans fait apparaître le tissu non marqué en rouge-marron.
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L’anticorps anti-collagène de type IV humain marque en jaune la jonction dermo-épidermique et les membranes basales des vaisseaux sanguins dans la peau humaine greffée alors que l’anticorps anti-collagène de type IV de souris décore uniquement ja jonction dermo-épidermique et les vaisseaux sanguins de la peau de souris et également ceux de la peau humaine greffée en raison de la présence de cellules endothéliales de souris dans le greffon.
  • enfin, ceux qui révèlent une distribution de l’antigène différente dans chacune des deux espèces tels que les anticorps monoclonaux AE1 ou KL1.

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